1、引言
果胶酶在工业上可用于果汁果酒澄清提取、果实脱皮、麻类脱胶、饲料添加剂、中药营养液深加工以及作为天然食品的防腐剂、改善果蔬的感官品质等。[1][2]近年来，随着我国果汁、果酒业的发展，果胶酶的需求也日益增加。目前关于果胶酶产生菌的研究主要集中在酶活较高的霉菌，对细菌的研究很少，然而霉菌生产果胶酶存在产酶周期长、耗氧量多、菌丝易缠结等不足，因此筛选具有高酶活性细菌具有广泛的应用价值。[3]
由于土壤中微生物大量存在，对其进行分离时应选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。但值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种生理生化反应鉴定才能得到[4] 。
2、材料与方法
2.1 含菌样品
含菌样品取自济南市西郊小清河河道污泥土壤
2.2 培养基
（1）富集培养基[5] ：牛肉膏5.0g/L、NaCl 5.0g/L、K2HPO4 1.0g/L、KH2PO4 0.3g/L、桔皮粉 20.0 g/L，pH 7.0。
（2）固体初筛培养基[6-7]：K2HPO4 1.0g/L、MgSO4 0.5 g/L、NaNO3 3.0 g/L、FeSO4 0.01g/L、果胶2.0 g/L、琼脂15.0g/L、pH7.0。
（3）保存培养基[5]：桔皮粉2.0 g，用100mL蒸馏水煮沸30min，4层纱布过滤后定容至100mL，加入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.1g、KH2PO40.03g、加琼脂2.0g煮沸，pH7.0。
（4）淀粉培养基[4] ：蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L、牛肉膏5.0/L、可溶性淀粉2.0g/L、琼脂15~20g/L。
（5）糖酵解培养基[4] ：蛋白胨 10.0g/L、NaCl 5.0g/L、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL/L、pH7.6。另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖）25mL。
（6）蛋白胨水培养基[4] ：蛋白胨5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、K2HPO4 2.0g/L、pH7.0~7.2。
2.3 方法
2.3.1 菌株分离筛选
采集土样后制备菌悬液，之后进行富集培养3~4天。梯度稀释后进行初筛，同时进行计数，而后对菌株进行复筛，选取有最大水解圈的单菌落。之后划线分离得到纯的单菌落，最后对单菌落进行保藏。
2.3.2 菌株形态及部分特征观察
在洁净的载玻片滴上一滴蒸馏水，使用牙签挑取适量的分离到的菌株均匀涂布于载玻片上，风干后热固定，然后使用结晶紫染色，置于光学显微镜下观察。
2.3.3 扫描电镜样品的制备
（1）将菌株用培养液洗涤1~2次，
10000rpm离心5分钟。
（2）用2.5%的戊二醛，4℃固定3h。
（3）0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH7.2~7.4）洗涤3~4次，每次10分钟。
（4）用不同浓度的乙醇梯度脱水，每个梯度15分钟，然后用无水乙醇脱水2次，每次15分钟。
（5）将菌液滴于盖玻片上，湿法搓片，在干燥器内自然干燥。
2.3.4 生理生化实验[4]
用固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基对菌株分别研究淀粉水解、糖发酵、产酸反应等微生物生理生化反应，并观察实验现象。
2.3.5 生长曲线的测定
由于对该细菌II的生长条件不了解，因此对其生长状况进行摸索，对以后发酵条件的优化有一定的帮助。接种7.5％(体积比)细菌II：菌悬液于牛肉膏蛋白胨培养基中，分别于25、30 和35℃，摇床(150 r／min)培养，确定其培养液的最大吸收波长为440 nm，每12 h在440nm处测定吸光度。
3、结果与分析
3.1 实验结果
3.1.1 菌落特征及计数
富集培养和初筛后，共得到两株菌株，其中一株为霉菌，编号为I。另一株为细菌，编号为II，细菌II菌落的大小宽为0.8~1.0um,长为2.5~3.0um。
3.1.2 菌体形态观察
（1）光学显微镜下菌体形态
光学显微镜下观察细菌II，细胞呈短杆状，两端稍细，无鞭毛，不滑动，革兰氏染色为阳性。
（2）细菌II的扫描电镜观察
喷金结束后在扫描电镜下观察菌的表面形态。在扫描电镜下观察菌II为梭状，菌体表面无鞭毛且表面粗糙。
3.1.3 菌株部分生理生化特性
菌II甲基红试验阳性，能水解淀粉，可以发酵葡萄糖产酸但不产气，不能利用乳糖。通过以上形态与部分生理生化特性试验，结合伯杰氏手册和真菌志手册[8]，推测菌II属于细菌中的芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）。
3.2结论
（1）从自然界中筛选到一株果胶分解菌II：其菌落特点为圆形、湿性、边缘整齐、中部隆起的黄色不透明菌落；光学显微镜下观察细菌II，细胞呈短杆状，两端稍细，无鞭毛，不滑动，革兰氏染色为阳性。
（2）在扫描电镜下观察菌II为梭状，菌体表面无鞭毛且表面粗糙。生理生化试验中，菌II甲基红试验阳性，能水解淀粉，可以发酵葡萄糖产酸但不产气，不能利用乳糖，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）。
（3）菌II生长相对比较缓慢，在30℃下培养60h后细菌数量达到最大值，稳定期可以延续到96h后。
参考文献：
[1]汤鸣强，卞矛，李琼华．米曲霉固体发酵生产果胶酶的研究[J]．福建师范大学福清分校学报，2006(2)：32-35．
[2]张红霞，江晓路，牟海津，等．微生物果胶酶的研究进展[J]．生物技术，2005，15(5)：92-95．
[3]朱宏莉，宋纪蓉，张嘉，等．果胶酶高产菌株的激光选育及发酵条件的优化[J]．食品科学，2005，26(12)：161-164．
[4]沈萍, 陈向东主编，2007．微生物学实验．高等教育出版社，76-81.
[5]王伟．产低温果胶酶菌株的筛选、发酵条件及酶学性质的研究[D]．新疆农业大学，2006．
[6]陈峰，俞吉安，张承康，等．果胶分解菌的简便筛选方法[J]．微生物学杂志，1999，19(4)：63．
[7]钱微军，陈海敏，陈建勇．大麻韧皮果胶分解菌株的分离及鉴定[J]．纺织学报，2006，27(11)：52．54．
[8]R·B·布坎南，N·E·吉本斯，等．伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M]．北京：科学出版社，1984：274．442．
果胶酶在工业上可用于果汁果酒澄清提取、果实脱皮、麻类脱胶、饲料添加剂、中药营养液深加工以及作为天然食品的防腐剂、改善果蔬的感官品质等。[1][2]近年来，随着我国果汁、果酒业的发展，果胶酶的需求也日益增加。目前关于果胶酶产生菌的研究主要集中在酶活较高的霉菌，对细菌的研究很少，然而霉菌生产果胶酶存在产酶周期长、耗氧量多、菌丝易缠结等不足，因此筛选具有高酶活性细菌具有广泛的应用价值。[3]
由于土壤中微生物大量存在，对其进行分离时应选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。但值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种生理生化反应鉴定才能得到[4] 。
2、材料与方法
2.1 含菌样品
含菌样品取自济南市西郊小清河河道污泥土壤
2.2 培养基
（1）富集培养基[5] ：牛肉膏5.0g/L、NaCl 5.0g/L、K2HPO4 1.0g/L、KH2PO4 0.3g/L、桔皮粉 20.0 g/L，pH 7.0。
（2）固体初筛培养基[6-7]：K2HPO4 1.0g/L、MgSO4 0.5 g/L、NaNO3 3.0 g/L、FeSO4 0.01g/L、果胶2.0 g/L、琼脂15.0g/L、pH7.0。
（3）保存培养基[5]：桔皮粉2.0 g，用100mL蒸馏水煮沸30min，4层纱布过滤后定容至100mL，加入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.1g、KH2PO40.03g、加琼脂2.0g煮沸，pH7.0。
（4）淀粉培养基[4] ：蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L、牛肉膏5.0/L、可溶性淀粉2.0g/L、琼脂15~20g/L。
（5）糖酵解培养基[4] ：蛋白胨 10.0g/L、NaCl 5.0g/L、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL/L、pH7.6。另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖）25mL。
（6）蛋白胨水培养基[4] ：蛋白胨5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、K2HPO4 2.0g/L、pH7.0~7.2。
2.3 方法
2.3.1 菌株分离筛选
采集土样后制备菌悬液，之后进行富集培养3~4天。梯度稀释后进行初筛，同时进行计数，而后对菌株进行复筛，选取有最大水解圈的单菌落。之后划线分离得到纯的单菌落，最后对单菌落进行保藏。
2.3.2 菌株形态及部分特征观察
在洁净的载玻片滴上一滴蒸馏水，使用牙签挑取适量的分离到的菌株均匀涂布于载玻片上，风干后热固定，然后使用结晶紫染色，置于光学显微镜下观察。
2.3.3 扫描电镜样品的制备
（1）将菌株用培养液洗涤1~2次，
10000rpm离心5分钟。
（2）用2.5%的戊二醛，4℃固定3h。
（3）0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH7.2~7.4）洗涤3~4次，每次10分钟。
（4）用不同浓度的乙醇梯度脱水，每个梯度15分钟，然后用无水乙醇脱水2次，每次15分钟。
（5）将菌液滴于盖玻片上，湿法搓片，在干燥器内自然干燥。
2.3.4 生理生化实验[4]
用固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基对菌株分别研究淀粉水解、糖发酵、产酸反应等微生物生理生化反应，并观察实验现象。
2.3.5 生长曲线的测定
由于对该细菌II的生长条件不了解，因此对其生长状况进行摸索，对以后发酵条件的优化有一定的帮助。接种7.5％(体积比)细菌II：菌悬液于牛肉膏蛋白胨培养基中，分别于25、30 和35℃，摇床(150 r／min)培养，确定其培养液的最大吸收波长为440 nm，每12 h在440nm处测定吸光度。
3、结果与分析
3.1 实验结果
3.1.1 菌落特征及计数
富集培养和初筛后，共得到两株菌株，其中一株为霉菌，编号为I。另一株为细菌，编号为II，细菌II菌落的大小宽为0.8~1.0um,长为2.5~3.0um。
3.1.2 菌体形态观察
（1）光学显微镜下菌体形态
光学显微镜下观察细菌II，细胞呈短杆状，两端稍细，无鞭毛，不滑动，革兰氏染色为阳性。
（2）细菌II的扫描电镜观察
喷金结束后在扫描电镜下观察菌的表面形态。在扫描电镜下观察菌II为梭状，菌体表面无鞭毛且表面粗糙。
3.1.3 菌株部分生理生化特性
菌II甲基红试验阳性，能水解淀粉，可以发酵葡萄糖产酸但不产气，不能利用乳糖。通过以上形态与部分生理生化特性试验，结合伯杰氏手册和真菌志手册[8]，推测菌II属于细菌中的芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）。
3.2结论
（1）从自然界中筛选到一株果胶分解菌II：其菌落特点为圆形、湿性、边缘整齐、中部隆起的黄色不透明菌落；光学显微镜下观察细菌II，细胞呈短杆状，两端稍细，无鞭毛，不滑动，革兰氏染色为阳性。
（2）在扫描电镜下观察菌II为梭状，菌体表面无鞭毛且表面粗糙。生理生化试验中，菌II甲基红试验阳性，能水解淀粉，可以发酵葡萄糖产酸但不产气，不能利用乳糖，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）。
（3）菌II生长相对比较缓慢，在30℃下培养60h后细菌数量达到最大值，稳定期可以延续到96h后。
参考文献：
[1]汤鸣强，卞矛，李琼华．米曲霉固体发酵生产果胶酶的研究[J]．福建师范大学福清分校学报，2006(2)：32-35．
[2]张红霞，江晓路，牟海津，等．微生物果胶酶的研究进展[J]．生物技术，2005，15(5)：92-95．
[3]朱宏莉，宋纪蓉，张嘉，等．果胶酶高产菌株的激光选育及发酵条件的优化[J]．食品科学，2005，26(12)：161-164．
[4]沈萍, 陈向东主编，2007．微生物学实验．高等教育出版社，76-81.
[5]王伟．产低温果胶酶菌株的筛选、发酵条件及酶学性质的研究[D]．新疆农业大学，2006．
[6]陈峰，俞吉安，张承康，等．果胶分解菌的简便筛选方法[J]．微生物学杂志，1999，19(4)：63．
[7]钱微军，陈海敏，陈建勇．大麻韧皮果胶分解菌株的分离及鉴定[J]．纺织学报，2006，27(11)：52．54．
[8]R·B·布坎南，N·E·吉本斯，等．伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M]．北京：科学出版社，1984：274．442．
