摘要:近年来,国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道,却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法,以市售机油为唯一碳源,从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株,并对其生长条件及降解特性进行研究,以期进一步应用于含油污水的治理。 

  关键词:微生物 机油污染废水 微生物降解 
 
  近年来,国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道,却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法,以市售机油为唯一碳源,从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株,并对其生长条件及降解特性进行研究,以期进一步应用于含油污水的治理。
 
1 材料与方法
1.1 土壤样品
  某石油库贮油罐附近的石油污染土壤,取样3份,按含油量由多至少编为1#,2#,3#。
1.2 培养基
  本试验选取两种无机基础培养基,(用蒸馏水配制并高压蒸气灭菌),编号分别为1#,2#,组成如下:
  1#基础培养基:p(KH2PO4)=0.5g/L,ρ(K2HPO4)=0.5g/L,P(MgSO4·7H2O)=0.2g/L,ρ(NaCl)=0.2g/L,p(CaCl2)=0.1g/L,ρ(NH4NO3)=1.0g/L,MnSO4痕量,FeCl3痕量。
  2#基础培养基:p(NaNO3)=2.0g/L,ρ(KH2O4)=0.2g/L,ρ(MgSO4.7H2O)=0.2g/L,ρ(酵母浸膏)=1.0g/L.
  含油培养基是向上述无机基础培养基中加入适量机油。固体培养基中加入质量分数为0.2%的琼脂。
1.3 优势菌筛分试验
1.3.1 选择富集培养
  称取土样各10g,加入到500mL1#含油培养基(含机油4mL)中,调pH值7.0,通气恒温30℃培养48h后,分别移取上述培养液5mL于45mL1#,2#含油培养基(含机油2mL)中,恒温30℃振荡培养。
1.3.2 平板分离
  制作1#,2#固体含油培养基平板苦干,用接种环蘸取振荡培养较好的菌液在相应平板划线,恒温30℃培养48h后平板划线分离,重复数次。选择生长状况良好的菌株进行平板扩大培养。
1.4 生长条件正交试验
  在保证供氧和氮、磷营养前提下,选择温度。油的质量浓度(以mg/L计)和pH值作为本次实验的三个因素进行三水平实验,方案见表1、表2。将平板培养48h的菌体刮下,5000r/min离心5min,分离得到湿菌体。向方案中每个样品加入0.5g湿菌体,培养60h后测定样品中油的质量浓度。
 
表1  ZL1菌株正交试验方案及试验结果
分组号 因素 测定结果ρ(油)/(mg.L-1) 降解测量ρ(油)/(mg.L-1)
温度/ ρ(油)/(mg.L-1) pH值
1 25 424 5.0 192 232
2 25 680 7.0 416 264
3 25 824 9.0 630 194
4 30 424 7.0 220 204
5 30 680 9.0 507 173
6 30 824 5.0 654 170
7 35 424 9.0 297 127
8 35 680 5.0 569 111
9 35 824 7.0 755 69
K1 690 563 513    
K2 547 548 537    
K3 307 433 494    
K1 230 188 171    
K2 182 183 179    
K3 102 144 165    
R 128 44 14
   
表2  ZL2菌株正交试验方案及试验结果
分组号 因素 测定结果ρ(油)/(mg.L-1) 降解测量ρ(油)/(mg.L-1)
温度/ ρ(油)/(mg.L-1) pH值
1 25 368 4.0 69 299
2 25 574 6.0 267 307
3 25 767 8.0 479 288
4 30 368 6.0 354 314
5 30 574 8.0 296 278
6 30 767 4.0 462 305
7 35 368 8.0 142 226
8 35 574 4.0 342 232
9 35 767 6.0 548 219
K1 824 769 766    
K2 897 817 840    
K3 677 812 792    
K1 275 256 255    
K2 299 272 280    
K3 226 271 264    
R 73 16 25    
 
1.5 降解能力试验
  配制机油质量浓度为270mg/L的含油培养基1L,投入小型间歇反应器中,加入离心分离得到的湿菌体5g,通气恒温30℃培养,间隔12h取样测定其含油量。
1.6 测试方法
  用紫外介光光度法测定。
 
2 结果分析
2.1 优势菌筛分试验
  富集培养过程中,1#土样的培养液出现的泡沫较多,乳化现象明显,菌液也较为粘稠,分离出较多的菌株,说明土壤中的石油烃能刺激石油降解菌的生长。经过选择富集培养、平板分离出4株以机油为唯一碳源的菌株,编号为ZL1,ZL2,ZL3,ZL4,性状见表3。进一步培养后筛选出降解性能较好的ZL1(1#培养基)和ZL2(2#培养基)进行正交试验和连续培养试验。
 
表3  4株机油降解菌形态特征
 
形态特征 ZL1 ZL2 ZL3 ZL4
菌落颜色 粉红 淡黄 淡黄 粉红
菌落形态 不透明,微隆起,全缘, 半透明,圆形 半透明,圆形,隆起, 不透明,米粒状突起,
  光滑,有光泽 光滑,较干燥 光滑,有光泽 较湿润
菌体形态 短杆 球形 杆状 丝状
菌体大小/μm (0.3-0.8)×(0.6-1.0) Φ0.3 (0.5-0.8)×(1.3-5.0) 0.2×(6-60)
革兰氏染色 G G G G
初步鉴定 黄杆菌属 微球菌属 假单胞菌属 酵母菌属
 
2.2 生长条件正交试验
  ZL1,ZL2菌株按设定的正交试验方案进行试验,测定其剩余含油量,以降解油量作为考察指标,计算结果见表2、表3。分析极差值R可以看出:ZL1菌的R温度为128,ZL2菌的R温度为73,均为最大极差值,说明温度是影响降解效果的主要因素。25℃ZL1菌降解机油能力较强;油质量浓度越低降解效果越好;pH值为7时,降解效果最好,说明ZL1菌适于在中性条件下生长。30℃ZL2菌降解机油能力较强;机油的质量浓度在368-767mg/L范围内对降解效果影响不大,以ρ(油)=574mg/L时降解效果最明显,还应进一步扩大试验的油含量范围以确定油含量对ZL2菌降解能力的影响;pH值在4-8范围内对降解效果的影响也不显著,其中PH值为6时降解效果最好,说明ZL2菌较适于在中性偏酸条件下生长。
2.3 降解能力试验
  向1L油质量浓度为270mg/L培养液中投加5g湿菌体进行间歇培养,考察ZLI,ZLZ菌的降解能力,结果见图1。由含油量与培养时间关系曲线可以看出:ZL1,ZL2菌被加人含油培养基后很快适应环境,随着培养时间的增长,含油量不断下降。ZL1菌在30h左右去除率达到最大,后含油量下降缓慢,到60h左右曲线趋于平直;ZL2菌在20h左右去除率达最大,48h左右曲线趋于平直。曲线说明ZL1,ZL2菌适应能力较强,ZL1菌在0-60h内生长旺盛对机油的去除率可达67.9%,ZL2菌在0-48h内生长旺盛,对机油的去除率高达76.2%,试验后期降解曲线趋于平直,含油量基本不再变化,可能是由于机油中的一些重组分难于降解的原因。
 
3 结论
  ①石油污染土壤较适于做高效石油降解菌驯化菌源。筛选到两株高效机油降解菌ZL1,ZL2。通过正交试验得出ZL1黄杆菌属适于在25℃,油的质量浓度在424mg/L左右,中性条件下生长。ZL2微球菌属适于在 30℃,油的质量浓度在574mg/L左右,中性偏酸条件下生长。
  ②温度对ZL1,ZL2菌的机油降解能力影响较大。ZL2菌的PH值、机油浓度适应范围较广,有较好的应用前景。
  ③ZL1,ZL2菌对初始机油质量浓度为270mg/L培养液的去除率分别达到67.9%和76.2%,混合菌株的降解效果有待进一步研究。